कोशिका विघटन और डीएनए/आरएनए निष्कर्षण के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग कैसे करें?

कोशिका विघटन और डीएनए/आरएनए निष्कर्षण के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग कैसे करें?

अल्ट्रासाउंड कोशिका विघटन और न्यूक्लिक एसिड (डीएनए/आरएनए) निष्कर्षण में एक कुशल और आम तौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीक है।इसका मूल सिद्धांत कोशिका संरचना को नष्ट करने और आंतरिक पदार्थों को मुक्त करने के लिए गुहा प्रभाव और यांत्रिक कंपन का उपयोग करना हैनिम्नलिखित विशिष्ट तंत्र, आवेदन प्रक्रिया और प्रमुख सावधानियों की व्याख्या हैः

I. कोशिका विघटन के लिए अल्ट्रासाउंड का सिद्धांत और प्रक्रिया
कोशिका विघटन का मूल कोशिका झिल्ली (पशु कोशिका) या कोशिका दीवार + कोशिका झिल्ली (पौधों, बैक्टीरिया, कवक, आदि) को नष्ट करने के लिए इंट्रासेल्युलर पदार्थों (जैसे न्यूक्लिक एसिड,प्रोटीनअल्ट्रासाउंड इस प्रक्रिया को निम्नलिखित तंत्रों के माध्यम से प्राप्त करता हैः
1मूल सिद्धांत: गुहा प्रभाव
अल्ट्रासाउंड एक उच्च आवृत्ति यांत्रिक तरंग है जिसकी आवृत्ति 20kHz से अधिक है। जब अल्ट्रासोनिक जांच (अल्ट्रासोनिक विघटनकर्ता का एम्पलीफायर) कोशिकाओं वाले तरल नमूने में डाला जाता है,उच्च आवृत्ति कंपन (आमतौर पर 15-50kHz) उत्पन्न होता है, जो तरल माध्यम में खोखलापन को ट्रिगर करता हैः

उच्च आवृत्ति के कंपन से तरल में बड़ी संख्या में छोटे बुलबुले (कैविटेशन बुलबुले) बनते हैं। ये बुलबुले दबाव में परिवर्तन के तहत तेजी से विस्तार और संकुचन करते हैं।और अंत में क्रूरता से फट गया (विघटन).
जब बुलबुले फटते हैं, तो बहुत बड़ी तत्काल ऊर्जा (स्थानीय उच्च तापमान, उच्च दबाव और मजबूत झटका तरंगें) जारी हो जाती हैं।और उत्पन्न प्रभाव बल सीधे सेल के झिल्ली संरचना फाड़ देगा (सेल झिल्लीकोशिका विखंडन प्राप्त करने के लिए।
2सहायक प्रभावः यांत्रिक कंपन और कतरनी बल
अल्ट्रासाउंड के उच्च आवृत्ति वाले यांत्रिक कंपन से कोशिकाओं पर सीधे कतरन बल और घर्षण बल उत्पन्न होगा, जिससे कोशिका संरचना को नष्ट करने में और सहायता मिलेगी,विशेष रूप से मोटी कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं के लिए (जैसे कवक और पौधे कोशिकाओं).
3विखंडन प्रक्रिया (प्रयोगात्मक संचालन का उदाहरण लेते हुए)
उपचार के लिए सेल सस्पेंशन (जैसे बैक्टीरियल कल्चर फ्लूइड, टिशू होमोजेनेट आदि) को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब या बीकर में डालें, अल्ट्रासोनिक जांच (हॉर्न) डालें,और जांच तरल में डुबोया जाना चाहिए लेकिन कंटेनर की दीवार के संपर्क में नहीं.

अल्ट्रासोनिक उपकरण चालू करें और पैरामीटर सेट करें (शक्ति, समय आदि): उच्च आवृत्ति कंपन तरल में गुहा बुलबुले उत्पन्न करता है,और बुलबुले के फटने से उत्पन्न प्रभाव बल सीधे कोशिका संरचना को नष्ट करता है और इंट्रासेल्युलर पदार्थों (न्यूक्लिक एसिड सहित) को मुक्त करता है, प्रोटीन, चयापचय आदि) ।
2डीएनए/आरएनए निष्कर्षण में अल्ट्रासाउंड का विशिष्ट अनुप्रयोग
डीएनए/आरएनए निष्कर्षण के मुख्य चरणों में शामिल हैंः न्यूक्लिक एसिड को रिलीज़ करने के लिए सेल विघटन → अशुद्धियों (प्रोटीन, लिपिड, पॉलीसाकेराइड, आदि) को हटाना → न्यूक्लिक एसिड की शुद्धिकरण।अल्ट्रासाउंड की भूमिका मुख्य रूप से पहले चरण में केंद्रित है - कुशल कोशिका विघटन और न्यूक्लिक एसिड रिलीजविशिष्ट अनुप्रयोग परिदृश्य और लाभ इस प्रकार हैंः
1उपयुक्त नमूना प्रकार
अल्ट्रासाउंड विभिन्न प्रकार के नमूनों के न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए उपयुक्त है, जिनमें निम्न शामिल हैंः

पशु ऊतक (जैसे जिगर, मांसपेशियों): पहले छोटे टुकड़ों में काटने की आवश्यकता होती है, अल्ट्रासाउंड कोशिकाओं को जल्दी से बाधित कर सकता है और न्यूक्लिक एसिड जारी कर सकता है;
बैक्टीरिया/फंगस: कोशिका की दीवारें अपेक्षाकृत कठोर होती हैं, पारंपरिक विधियां (जैसे लाइसोजाइम उपचार) अप्रभावी होती हैं और अल्ट्रासाउंड मजबूत गुहा प्रभाव के माध्यम से कोशिका की दीवारों को नष्ट कर सकता है।
कल्चर की गई कोशिकाएं (अडेसिव या सस्पेंडेड कोशिकाएं): सीधी सस्पेंशन और फिर अल्ट्रासाउंड, कोई जटिल पूर्व उपचार की आवश्यकता नहीं है;
पौधे के ऊतक में सेल्युलोज और पेक्टिन होता है, अल्ट्रासाउंड कोशिकाओं की दीवारों को तोड़ने और कोशिकाओं की सामग्री को मुक्त करने में मदद कर सकता है।
2संचालन में प्रमुख मापदंड (न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाले)
अल्ट्रासोनिक उपचार के लिए न्यूक्लिक एसिड अपघटन या अत्यधिक विखंडन से बचने के लिए मापदंडों के सख्त नियंत्रण की आवश्यकता होती है (जो बाद के प्रयोगों को प्रभावित करता है, जैसे पीसीआर, अनुक्रमण, आदि):

शक्तिः आमतौर पर 50-300W (नमूने के प्रकार के अनुसार समायोजित, जैसे बैक्टीरिया को अधिक शक्ति की आवश्यकता होती है) । बहुत अधिक शक्ति न्यूक्लिक एसिड कतरनी को बहुत कम करने का कारण बनती है,और बहुत कम शक्ति अपर्याप्त विखंडन का परिणाम होगा.
काम का समय/अंतराल समयः Use "pulse" treatment (such as working 30 seconds + intermission 30 seconds) to avoid continuous ultrasonic heat generation leading to nucleic acid denaturation (DNA/RNA is easily degraded at high temperature).
कुल उपचार समय: नमूना पर निर्भर करता है (जैसे पशु कोशिकाओं के लिए 1-3 मिनट और बैक्टीरिया के लिए 3-5 मिनट) । अत्यधिक उपचार न्यूक्लिक एसिड विखंडन को बढ़ाएगा।
तापमान नियंत्रणः प्रक्रिया के दौरान बर्फ से स्नान (प्रोटेक्ट्स को बर्फ पर रखा जाता है), क्योंकि अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया गर्मी उत्पन्न करेगी (स्थानीय उच्च तापमान के साथ गुहा प्रभाव),निम्न तापमान न्यूक्लेज़ गतिविधि को बाधित कर सकता है और न्यूक्लिक एसिड स्थिरता की रक्षा कर सकता है.

3लाभ और सावधानियां
लाभ
उच्च दक्षता: पारंपरिक तरीकों (जैसे पीसने, बार-बार फ्रीज करने और पिघलने, एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस) की तुलना में तेज़ (आमतौर पर कुछ ही मिनटों में पूरा) और अधिक गहन विघटन;
विश्वव्यापीताः विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकारों (पशुओं, पौधों, सूक्ष्मजीवों, आदि) पर लागू होता है;
प्रचालन में आसानः कोई जटिल अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है, केवल अल्ट्रासोनिक उपकरणों और बुनियादी केन्द्रापसारक उपकरण की आवश्यकता है।
सावधानियां
बुलबुले से बचेंः यदि नमूना में बड़ी संख्या में बुलबुले हैं, तो गुहाकरण प्रभाव की दक्षता कम हो जाएगी, और जांच अधिक गर्म हो सकती है।सुनिश्चित करें कि जांच पूरी तरह से तरल में डूब गया है (तरल स्तर लगभग 1-2cm है);
न्यूक्लेज़ अवरोधः विघटन के बाद, इंट्रासेल्युलर न्यूक्लेज़ (जैसे आरएनएज़ जो आरएनए को आसानी से नष्ट करता है) को अवरोधित करने के लिए समय पर लिसीस समाधान (ईडीटीए, डिटर्जेंट आदि सहित) जोड़ा जाना चाहिए;
नमूना मात्राः एकल प्रसंस्करण मात्रा बहुत बड़ी नहीं होनी चाहिए (आमतौर पर ≤5mL), अन्यथा अल्ट्रासोनिक ऊर्जा वितरण असमान होगा और विघटन प्रभाव बहुत भिन्न होगा।

सारांश
अल्ट्रासाउंड कुशलता से गुहा प्रभाव और यांत्रिक कंपन के माध्यम से कोशिकाओं को बाधित करता है, डीएनए / आरएनए निष्कर्षण के लिए एक प्रमुख "रिलीज़ चरण" प्रदान करता है।न्यूक्लिक एसिड अखंडता की सुरक्षा को अधिकतम करते हुए कोशिकाओं को पूरी तरह से बाधित करने के लिए समय और तापमानइस तकनीक का व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान प्रयोगों (जैसे जीन क्लोनिंग, क्यूपीसीआर, ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण आदि) के पूर्व-प्रसंस्करण चरण में उपयोग किया जाता है।) और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है.